一、基本原理

细胞热迁移分析技术（Cellular Thermal Shift Assay，CETSA）是一种用于检测细胞内药物与靶蛋白结合效率的实验技术，其基本原理是基于蛋白质的热稳定性；在细胞内，当药物与靶蛋白结合时，靶蛋白的结构会变得更加稳定，从而在升高的温度下不易发生变性，因此，与未结合药物的蛋白相比，结合了药物的蛋白在相同的温度下会有更多的未降解蛋白；这一现象可以通过测量不同温度下的蛋白降解情况来观察，通常使用免疫印迹（Western blotting）或质谱（MS）等方法进行检测。

二、实验流程

1. 细胞准备

细胞培养：选择合适的细胞系，如HEK 293T细胞，进行培养；确保细胞处于良好的生长状态。

转染：如果需要，将构建好的质粒瞬时转染到细胞中，以便在细胞内表达特定的蛋白；通常使用脂质体转染试剂，按照制造商的方案进行操作。

药物处理：将细胞暴露于DMSO（对照组）或待测试的药物中，孵育一定时间（例如24小时），以确保药物充分与靶蛋白结合。

2. 细胞裂解

洗涤：收集细胞，用含有蛋白酶抑制剂（如1 mmol/L PMSF或50×cocktail）的PBS洗涤细胞，以防止蛋白降解。

重悬：将细胞重悬于PBS中，调整细胞密度至2×10^7 cells/ml。

3. 温度梯度处理

分装：将细胞分装到多个PCR管中，每管含有相同数量的细胞。

加热：将PCR管置于热循环器中，在不同的温度（例如37℃至67℃）下加热3分钟，使蛋白质变性；每个温度点设置至少三个重复样本，以确保结果的可靠性。

4. 细胞裂解和冻融

裂解：将加热后的细胞重悬于NP40缓冲液中，用液氮进行3次冻融循环，以彻底裂解细胞。

离心：将裂解后的细胞悬液在4℃、20,000×g离心20分钟，收集上清液；上清液中含有未降解的蛋白，而沉淀物中则是已经降解的蛋白。

5. 蛋白检测

Western blotting：取20 μL上清液，加入等量的2×SDS loading buffer，沸水浴中灭活10分钟；然后进行SDS-PAGE电泳，转移到PVDF膜上，用特异性抗体进行免疫印迹，检测目标蛋白的表达量。

质谱分析：如果需要进行高通量检测，可以将上清液送至质谱公司进行蛋白质谱分析，以获得更详细的蛋白信息。

三、应用

1. 药物靶点验证

药物结合：CETSA可以验证药物是否与预期的靶蛋白结合，通过比较药物处理组和对照组的蛋白降解情况，可以确定药物与靶蛋白的结合效率。

脱靶效应：CETSA还可以用于检测药物的脱靶效应，即药物是否与非预期的蛋白结合；这有助于评估药物的安全性和特异性。

2. 蛋白-蛋白相互作用

相互作用验证：CETSA可以用于研究细胞内蛋白-蛋白相互作用，通过观察不同温度下蛋白的降解情况，可以判断两种蛋白是否发生相互作用。

相互作用强度：CETSA还可以提供关于蛋白-蛋白相互作用强度的信息，这对于理解生物过程中的调控机制非常重要。

3. 药物筛选

高通量筛选：结合质谱技术（MS-CETSA），CETSA可以用于高通量筛选潜在的药物候选物；通过大规模的温度梯度实验，可以快速鉴定出与目标蛋白结合的化合物。

四、局限性

尽管CETSA技术具有许多优点，但也存在一些局限性：

灵敏度：并非所有蛋白-蛋白相互作用都会产生明显的CETSA位移，因此某些相互作用可能难以检测。

结构信息：CETSA通常无法提供具体的结构信息，特别是当蛋白质存在多个相互作用对象时。

细胞定位：CETSA无法直接提供药物在细胞内的具体定位信息，需要结合其他技术进行进一步研究。

文章出自：细胞实验外包   想了解更多请关注：http://www.dj-cro.com/